背景介绍
近年来，生物工程蛋白质药物市场是制药和生物技术市场中增长最快的领域之一。然而，治疗性蛋白质的基本剂型是冻干剂，由于吸收效率低、生物半衰期短的特点，其临床疗效受到了很大的限制。传统的蛋白制剂通常需要通过频繁注射的方式以达到理想的治疗效果，但是这一方式增加了与剂量过量相关的不良副作用的风险，同时还降低了患者依从性。因此，开发能够长期控释蛋白药物的原位递送系统在减少不良反应和改善患者生活质量方面具有重要意义。
清华大学孙伟教授团队和英国诺丁汉大学 Jing Yang教授团队共同开发了一种新型双网络（DN） 水凝胶系统，利用亲和控释原理以及双网络材料中致密的网络结构，可实现抗病毒蛋白的长期平稳释放。该系统采用海藻酸（ALG）/聚乙二醇二丙烯酰酯（PEGDA）网络来改善水凝胶的机械性能以及网络密度，加入带正电荷的单体 2-(丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化铵 (AETAC)与模型蛋白电负性的抗人乳头瘤病毒（HPV）蛋白（3-羟基邻苯二甲酸酐修饰的牛β-乳球蛋白）产生静电相互作用以实现延缓释放的效果。与 PEGDA SN 水凝胶与ALG SN 水凝胶相比，ALG/PEGDA-AETAC DN 水凝胶具有稳定高、机械强度好、柔性佳的特点。同时，DN 水凝胶显着缓解了抗病毒蛋白的突释，将释放时间延长至14 天以上。结合研究者前期研究设计的仿生宫颈重构模型，采用数字光处理（DLP）技术打印DN水凝胶，可构建个性化载药宫颈仿生植入物，为宫颈癌患者锥切术后的组织原位修复以及抗病毒治疗提供了可能。该研究所开发的ALG/PEGDA-AETAC DN 水凝胶可以作为长期释放负电蛋白质的载体，良好的机械性能以及生物相容性显示了未来应用于软组织原位递送的潜力。
实验过程及结果
1. 双网络凝胶的制备
研究者采用两步交联法制备双网络水凝胶，首先海藻酸钠与氯化钙发生离子交联形成脆性网络。经过紫外光照射后，PEGDA与AETAC单体在光引发剂的作用下发生化学交联形成柔性网络。
图1. 双网络水凝胶的制备原理与过程
2. 双网络水凝胶的性能表征
水凝胶的力学测试结果显示，ALG/PEGDA-AETAC DN 水凝胶的抗压强度高于 PEGDA-AETAC SN 水凝胶。当 Igracure 2959 的浓度不低于 0.2% w/v时，ALG/PEGDA-AETAC DN 水凝胶的压缩模量是 PEGDA-AETAC SN 的两倍以上。此外可变的Igracure 2959 浓度提供了水凝胶的可调节的压缩性能。除此之外，相比于SN水凝胶，DN水凝胶具有更低的溶胀系数以及更致密的孔隙结构，这种结构的形成进一步延缓了药物的释放，并在调节药物释放中起关键作用。
图2. 双网络水凝胶的力学性能、溶胀系数以及微观形貌表征
3 双网络水凝胶的细胞毒性测试
生物相容性是确定水凝胶是否可以进一步使用的先决条件。在这项研究中，研究者评估了 SN 和 DN 水凝胶浸提液中 NIH 3T3 细胞和 HUVECs 的生长，以验证它们的细胞毒性。如图3所示，CCK8检测和细胞活/死染色均证明ALG/PEGDA-AETAC和 PEGDA-AETAC水凝胶几乎没有细胞毒性。根据ISO 10993-5:2009细胞毒性分类标准，细胞毒性等级为一级，为无毒，为将来的临床应用提供了可能性。
图3. SN与DN水凝胶的细胞毒性表征
4 双网络水凝胶的蛋白释放特性
随后，研究者比较了不同成分的水凝胶的蛋白释放动力学曲线，发现DN水凝胶对抗HPV蛋白的控释作用比SN水凝胶强。此外，带正电基团 AETAC 的加入增强了水凝胶的控释作用，这主要是由于AETAC的正电基团可与带负电荷的抗 HPV 蛋白发生静电相互作用。因此，ALG/PEGDA-AETAC对抗HPV蛋白的控释效果最好，可以实现抗HPV蛋白长达14天的平稳释放。
图4. 抗病毒蛋白于不同水凝胶中的释放动力学曲线
5 双网络水凝胶的可打印性表征
研究还探索了DN水凝胶的可打印性以及潜在应用，在经过DLP 3D打印后即可形成预定结构。为了验证可行性，研究者打印了字母结构以及具有中空结构的锥体，可以观察到ALG / PEGDA-AETAC DN水凝胶可以根据预设模型形成复杂的结构，上述锥体结构可用作宫颈癌锥切手术后的组织补片。此外，研究者还发现所打印的结构可以在压缩50%以上后恢复初始形态，这表明DN水凝胶具有良好的柔性以及在软组织工程领域巨大的应用潜力。
图5. DN水凝胶的可打印性测试
6 结论
本文报道了一种新型DN 水凝胶，其主要成分是 PEGDA、海藻酸钠和带正电荷的单体 AETAC。通过调节光引发剂的浓度，可以制备出与人体软组织模量相匹配的DN水凝胶。此外，细胞毒性测试显示所制备的DN 水凝胶支持细胞生长。基于 ECM 中受控释放启发的亲和控制递送机制，DN水凝胶中的正电基团AETAC可以通过静电相互作用来抑制负电蛋白的突释并实现延长释放时长的效果（超过 14 天）。与 SN 水凝胶相比，DN水凝胶中更致密的网络结构也有助于蛋白的持续释放。此外，该材料可以通过DLP 3D打印技术构建出具有高弹性的复杂结构，在组织工程中具有巨大的应用潜力。
（采编：www.znzbw.cn）
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