图1 多材料生物打印策略的示意图
为了将GelMA的最佳打印性能和纤维蛋白的血管生成性能结合起来，研究者使用了由GelMA和纤维蛋白混合物组成的载细胞墨水。SEM图像显示，随着GelMA浓度的降低，连通孔隙的平均尺寸增大，并且纤维蛋白添加后，孔的平均尺寸减小。多孔结构可促进营养物质扩散，提高细胞存活率。为了评估墨水的生物相容性，将含有不同荧光的细胞共同包被在GF基质中，并使用共聚焦显微镜定量毛细血管样网络形成的程度。结果表明，水凝胶中形成了毛细管样结构。3% GelMA + 0.25% 纤维蛋白（3GF）中形成的毛细血管样结构比3% GelMA（3G）或5% GelMA + 0.25% 纤维蛋白（5GF）中更丰富、更长。因此，在接下来的研究中，3GF被选择作为载细胞墨水。（图2）
图2 GF水凝胶的表征和毛细血管状网络的形成
墨水的粘度是影响打印过程的重要因素之一。为此，研究者评估了在不同温度条件下GelMA的粘度。并且对粘度数据进行拟合，建立了表征粘度-温度-浓度的三维热图。结果发现，3%GelMA在零度温度以上，能实现粘度可控的最低浓度。使用电驱动挤压GelMA，并调节温度控制系统以保持生物墨水处于凝胶状态。为了设计和制造血管化组织结构，研究者设计并打印了几种不同的结构体来演示具有通道结构的稳定打印结构体的形成。（图3）
图3 3D打印血管结构
为了为长期培养提供稳定的灌注，研究者制作了一个连续流灌注系统。将HUVEC和MSC作为单细胞，用3GF包被打印并进行比较，研究了灌注培养过程中单个细胞和多个细胞聚集的活力。结果发现，打印的细胞可随着时间的推移而增殖。接下来为了证明血管化组织的形成，研究者使用HUVEC和HFF共培养聚集物进行打印，与3GF水凝胶培养3天后，进行血管形成和管腔形成的形态学评估。结果发现打印出来的组织显示多个细胞聚集，并形成毛细血管样网络。将HUVEC植入构建的通道中，经过一夜的连续灌注培养后，细胞聚集，仍可维持较高的细胞密度。（图4）
图4 组织灌注培养和聚集打印在体外形成血管网
为了在体外构建肝脏模型，研究者将HUVECs、MSCs和HepG2聚集物封装在水凝胶中，观察细胞的分布以及相关基因的表达。打印组织显示HUVECs和MSCs形成毛细血管样网络，并出现多个细胞聚集。通过PCR测定相关基因的表达，来评估该肝单元的功能。最终选择培养7天的肝组织进行进一步实验。将打印的组织植入小鼠腹膜下，选择3GF水凝胶作为对照。结果发现在移植后第7天肝组织出现新生血管。最后研究者通过大鼠动脉血管移植，证明了这些组织可以直接用于手术吻合宿主血管。（图5）
图5 血管化肝组织的制造
综上所述，本研究首次证明了可以使用低浓度的GelMA和纤维蛋白作为生物墨水，以挤压为基础打印血管化组织。这种基于3D打印的方法使我们能够在厘米级组织中构建具有活性组织功能的血管网络。此外，它为药物筛选、研究人体组织发育和疾病，以及明确肝组织工程移植治疗开辟了一条可行的途径。
参考文献
Xin Liu,Xinhuan Wang， et al. 3D Liver Tissue Model with Branched Vascular Networks by Multimaterial Bioprinting. Advanced Healthcare Materials
https://doi.org/10.1002/adhm.202101405
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